مصطفی خمینی در اول آبان ۱۳۵۶ در سن ۴۷ سالگی درگذشت. او تا پیش از مرگ بیماری جدی نداشت. اما آن‌گونه که آیت‌الله محمد رضا رحمت از هم‌راهان و شاگردانش می‌گوید از بیماری ریوی و نوعی آسم رنج می‌برده است.

هم‌چنین وی وزن بالایی داشته است. سید محمود دعایی مرگ وی را این‌چنین شرح می‌دهد: «آن روز صبح، من برای تهيه نان بيرون رفته بـودم. هـنـوز آفـتاب نزده بود، ديدم، ننه صغری كه بسيار مورد احـتـرام ما بود؛ فرياد می‌كشد و پای برهنه می ‌دود و به سرش می‌زنـد. من از ديدن اين صحنه بسيار متاثر شدم.»

دعایی ادامه می‌دهد: «پيرزن می‌گفت: خاك بر سرم شد، آقا بدو. من فوق‌العاده وحشت زده شدم و به ذهنم چيز ديگری آمد. گفتم: چی شده؟ گفت: آقا مصطفی مريض است. سراسيمه رفتم ديدم كه ایشان پشت سجاده‌شان دراز كشيده‌اند.....نخست بسيار تلاش كردم با پزشكان بيمارستان نجف تماس بگيرم، ولی ايـن توفيق را نداشتم، بلافاصله خود را به بيمارستان رساندم، آن‌هـا آن قـدر آمـادگی نداشتند كه يك آمبولانس بفرستند. اين لحظات بـرای مـن بـسـيـار سخت می‌گذشت. آن جا تصميم گرفتم اين خبر را بـدون ايـن كـه ايجاد وحشت و نگرانی كند، به منزل امام برسانم. طلبه‌ای آن جا بود، به او گفتم: به منزل امام مـی‌روی و فـقـط احمدآقا را خبر می‌كنی و می‌گويی، خيلی فوری به مـنزل اخوی سر بزند.»

دعایی سپس می‌گوید: «آن طلبه هم رفت و احمد آقا را صدا زد و ما مـوفـق شـديم با يك تاكسی كه به زحمت می‌توانست به كوچه بيايد، ايـشـان را بـه بـيمارستانی ببريم. متاسفانه در بيمارستان پـزشـك كشيك پس از معاينات اوليه، تشخيص داد ايشان از دنيا رفته‌اند.»

سید علی اکبر محتشمی‌پور که آن روز‌ها در نجف زندگی می‌کرده و در جلسات درس مصطفی خمینی حضور داشته است می‌گوید مصطفی خمینی در روز قبل از مرگ به روال معمول جلسه درسش را برگزار کرده و در کلاس پدرش نیز حضور یافته است. هم‌چنین نماز ظهر و عصر را در مسجد شیخ انصاری و نماز شب را در مسجد آیت‌الله بروجردی خواند. شب قبل از مرگش سید محمود دعایی پزشکی را برای درمان همسرش به منزل وی می‌برد و هم‌چنین در آخر شب نیز میهمانانی داشته است. 

اولین کسی که متوجه حالت غیرعادی مصطفی خمینی می‌شود، صغری خانم کارگر خانه بوده است. مصطفی خمینی بدون بیماری قبلی و به یک دفعه صبح روز یکشنبه اول آبان ۱۳۵۶ در اتاق کارش بی‌هوش بر روی میز افتاده بوده است. وی قبل از رساندن به درمانگاه نجف جان داده بود.

اولین کسانی که در منزل وی حضور یافتند بعد از سید محمود دعایی، احمد خمینی و همسرش بودند.

فاطمه طباطبایی سلطانی ماجرا را چنین تعریف می‌کند: «من نجف بودم و اتفاقا این طور هم شد که صبح ما خواب بودیم، امام یک ضربه به در زدند و آمدند بالا و گفتند: احمد، پاشو از منزل مصطفی زنگ زدند، کمک خواستند. احمد بلند شد و لباس پوشید و من گفتم شاید معصومه خانم احتیاج به کمک دارد، چون شب پیش معصومه خانم دل درد کرده بود. گفتم: شاید ایشان کار دارد. احمد بلند شد و با عجله رفت خانه حاج آقا مصطفی، من هم دلم شور افتاد، گفتم من هم بروم شاید معصومه خانم احتیاج به کمک داشته باشد. آن موقع حسن آقا کوچک بود، من یواش حسن را که خواب بود برداشتم و بردم پایین گذاشتم بغل رختخواب خانم. ساعت ۷-۶ صبح بود، به آقا گفتم آقا من هم رفتم که ببینم چی هست، من که رسیدم خانه حاج آقا مصطفی، پشت در دیدم احمد آقا روی پله ایستاده و یک ماشین کوچکی هم جلوی خانه حاج آقا مصطفی بود، چون کوچه باریک بود و هر ماشینی آن‌جا قرار نمی‌گرفت».

وی سپس ادامه می‌دهد: «حاج آقا مصطفی تو ماشین بود، ولی احمد ناراحت و پریشان و گریه می‌کرد، گفتم احمد چی شده است، گفت: داداش. همین را از او شنیدم سوار ماشین شد، آن‌ها رفتند، من رفتم داخل خانه، معصومه خانم بود و مریم، پرسیدم چی شده، قضیه را گفتند که صبح که صغری رفته خاکشیر برده، ایشان دمر روی متکا افتاده بوده، چون عادت داشت می‌نشست و یک بالش روی پایش می‌گذاشت و دولا می‌شد و مطالعه می‌کرد صغری (کارگر) صدا کرده، وقتی جواب نداده آمده گفته: معصومه خانم بلند شوید که آقا حال‌شان خوب نیست. وقتی معصومه خانم رفته بالا، دیده که صورتشان کبود شده،‌‌ همان موقع کسی را فرستاده گفته برو خانه آقا بگو. خلاصه طول کشید، من نشستم پیش معصومه خانم، دیدم بعد از مدتی خانم وارد شدند، حالا ما فکر می‌‌کردیم که بعدا کسی به خانم خبر می‌دهد، خانم آمدند ما هم رفتیم جلو که بگوییم خانم نگران نباشید، دیدم ایشان وارد شدند و شروع کردند به گریه کردن. گفتیم: خانم چیزی نیست، گفت: چی چیزی نیست، فوت کرد، فوت کرد مصطفی و زدند تو صورت و سرشان.»

سید محمود دعایی نیز نفری را فرستاده بود تا بدون این‌که آیت‌الله خمینی متوجه شود، سید احمد را در جریان مسائل اتفاق افتاده قرار دهد. اما گویا فرستاده معصومه حائری یزدی زودتر می‌رسد و آیت‌الله خمینی متوجه می‌شود وضعیت در خانه پسر ارشدش عادی نیست.

بعد از بازگشت سید احمد خمینی به منزل و سکوت وی، آیت‌الله خمینی در می‌یابد که پسرش مرده است. همسر سید احمد خمینی که ناظر این صحنه بوده است می‌گوید وی سکوت کرده و فقط گفت انا لله و انا الیه راجعون.

فردوسی‌پور نیز چنین می‌گوید: «… وقتی حاج آقا احمد (با خبر مرگ سید مصطفی) از بیمارستان برگشت من منزل امام بودم، امام حاج احمد آقا را صدا زد که از مصطفی چه خبر؟ حاج احمد آقا جواب نداند امام دوباره سؤال کردند بار دوم باز احمد آقا جواب نداد. بار سوم امام فرمود مصطفی مرده چرا حرف نمی‌زنی؟ که احمد آقا بغضش ترکید وشروع کرد به گریه کردن. امام هم فرمود: ” انا لله وانا الیه راجعون”.»

اما روایت احمد خمینی تفاوت اندکی دارد: «امام گفتند: "بگویید احمد بیاید". من خدمت ایشان رفتم و گفتند: "من می‏‌خواهم به بیمارستان بروم و مصطفی را ببینم". با ناراحتی زیاد بیرون آمدم و به آقای رضوانی گفتم: که ایشان چنین مطلبی گفته‏‌اند، خوب است به ایشان بگوییم، دکتر، ملاقات با حاج آقا مصطفی را ممنوع کرده است که حتی‏‌المقدور امام دیر از جریان مطلع شوند. قرار شد، این‌طور مطلب را بگویند، در حالی که آن‌ها هم از طرح این قضیه وحشت داشتند. در طبقه بالا از پنجره‏ای که در طبقه بالا بود امام مرا دید، صدا زد. گفت: "احمد" من به خدمت ایشان رفتم، گفتند: "مصطفی فوت کرده؟" من هم بسیار ناراحت شدم و در حال گریه چیزی نگفتم. ایشان همان‌‏طور که نشسته بودند و دست‌های‌شان روی زانو قرار داشت، چندبار انگشتان‌شان را تکان دادند و سه بار گفتند: "انّا للّه و انّا الیه راجعون" تنها عکس‏‌العمل‌شان همین بود، هیچ واکنش دیگری نشان ندادند.»

آیت الله خمینی در کل مراسم تشییع و تدفین و ختم سید مصطفی خمینی گریه نکرد. رفتار عادی داشت. حتی حاضر نشد شیوه حضور کوتاه خود در مراسم تشییع که به مدت ده دقیقه در ابتدای مراسم حضور یافته و سپس به منزل بر می‌گشت را در مورد پسرش تغییر دهد. او در صحنه خاک‌سپاری پسرش در حرم علی‌بن ابیطالب شرکت نکرد و نماز نیز بر سر جنازه وی نخواند. آیت‌الله خویی با کسب اجازه قبلی نماز میت را خواند.

مرگ غیرمنتظره مصطفی خمینی در آن روزگار بلافاصله بحث برانگیز شد و با توجه به سابقه منفی حکومت پهلوی، انگشت اتهام به سمت ساواک رفت و تصوری پدید آمد که مصطفی خمینی توسط مامورین ساواک مسموم شده است. عده‌ای نیز گمان بردند که دولت وقت عراق برای اخلال در قرار داد الجزایر این کار را انجام داده است. اما تئوری توطئه فقط محدود به این گزینه نیست بلکه اخیرا نیز عده‌ای نظریه‌ای را مطرح می‌کنند که برخی از روحانیون انقلابی به دلیل مخالفت مصطفی خمینی با روی‌کرد رادیکال سیاسی وی را کشته‌اند تا هم مانعی را بر دارند و هم زمینه را برای گسترش امواج انقلاب مساعد سازند.

دامنه این اتهام زنی خود آیت‌الله خمینی را نیز در بر می‌گیرد. صحبت‌هایی نیز از سوی دلایل ناگفته مرگ مصطفی خمینی از سوی خانواده وی نیز به گوش می‌رسد که به طرح این ادعا دامن زده است.